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Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie

Laboratoriumsmethoden und -geräte, lichtmikroskopisches Fluoreszenzverfahren, bei dem die Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffes durch nichtresonante simultane Absorption von zwei Photonen (Zweiphotonenabsorption) der halben Energie der Fluoreszenzanregung vonstatten geht. Die Menge der erzeugten Fluoreszenzphotonen hängt dabei quadratisch von der Intensität des Anregungslichtes ab. Um eine entsprechend hohe Fluoreszenzausbeute zu erhalten, werden gepulste Laser als Anregungsquellen verwendet. Anwendung finden Lichtpulse im Picosekunden- und Femtosekundenbereich. Folgende Abhängigkeit kann gezeigt werden:

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Dabei ist t die Pulsdauer, f die Repetitionsrate bei der Erzeugung der Lichtpulse und PAnregung die mittlere Lichtleistung des Lasers. Durch die quadratische Abhängigkeit der Wahrscheinlichkeit eines Fluoreszenzereignisses von der Intensität des Anregungslichts finden Fluoreszenzereignisse praktisch nur im Fokus des Mikroskopobjektivs statt. Damit ist diese Technik der Fluoreszenzmikroskopie per se bereits konfokal, beschränkt die Beobachtung also auf einen sehr dünnen optischen Schnitt mit den typischen Vorteilen der Konfokalmikroskopie. Ein weiterer Vorteil dieser Technik liegt darin, dass bei stark streuenden Präparaten der Wirkungsquerschnitt der Rayleigh-Streuung (~ l-4) bei grossen Wellenlängen sehr klein ist. Damit sind höhere Eindringtiefen in dicke Präparate möglich. Ein Nachteil besteht, neben der komplizierten Gerätetechnik, im geringeren optischen Auflösungsvermögen. (konfokales Auflösungsvermögen, konfokales Fluoreszenzmikroskop)

 

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